תבליכי רישום פטנט ים בישראל ובמקומות נוספים

בזכות פתרונות המבנה של רנא פטנט באאוקריוטים נראה שיודעים איך פועל המנגנון, כנראה שכל עשירית שנייה יותאמו שני הגדילים של ה פטנטים בחזרה. יש תת יחידה מיוחדת לרנא פטנט Rudder שמפרידה את שני הגדילים של ה פטנטים לשני כיוונים שונים והיא זאת שבונה את האתר הפעיל ויוצרת מעין גשר של גדיל התבנית. הגשר הזה מופיע בכל מני קונפורמציות והסיקו שהמבנה של ההיבריד הוא שקובע איזה נוקליאוטיד ייכנס. השלמת הריאקציה ומילוי האתר הפעיל משנה את הקונפורמציה, נחסם האתר הפעיל אבל השינוי של הקונפורמציה חזרה גורם לתזוזה של נוקליאוטיד אחד לאתר פעיל לנוקליאוטיד הבא בתור. זה מדומה לגלגל שיניים. גלגל השיניים דואג כל פעם לחשוף את האתר הפעיל המתאים ושומר על הסדר של הריאקציה. ? הריאקציה: מה שבני אדם עשו כדי להסביר תוצאות ניסיוניות זה מודל של תהליך התקדמות הריאקציה. השלב הראשון בחיפוש פטנטים . הוא הכרה וזיהוי ה-template. הפרומוטר מזוהה עי האנזים במהירות עצומה. השלב הזה מחולק לשניים- (1) שלב זיהוי וקישור template recognition שהפטנט נקשר ל פטנטים ונוצר קומפלקס סגור (2) יצירת קומפלקס פתוח עי התכת הפטנטים unwinding- בועית השעתוק. רנא פטנט יודע להתחיל בפעולת הליקאז ולפתוח רצף מסוים בקומפלקס, ה- template נגיש. בועית השעתוק מתחילה, האיניציאציה כבר יכולה להתחיל, נוקליאוטידים יכולים להתחיל להתחבר אבל יש מצב של הפלה כל הזמן, הרנא הקצר שמסונתז כל הזמן נופל.

אתרי רישום פטנטים ישראליים

כנראה שבאתר הפעיל ובגדיל הפתוח שנוצר יש מקום ל-9 בסיסים בלבד כי אם מגיעים לבסיס העשירי כבר יש מעבר לשלב הבא, האנזים עוזב את הפרומוטר. האיניציאציה אם כן היא יצירת קשר ראשון בין נוקליאוטידים עד ל-9 בסיסים. רק אחכ הוא בורח מה פרומוטר ורץ על גבי הפטנטים- אלונגציה. יש לו אפיניות כללית לפטנטים, לא משנה מה המבנה שלו. הוא יידע לנתק קשרים ולעבוד עליו. כשהוא מגיע לנקודה מסוימת ספציפית פר יחידת טרנסקריפט מתבצע תהליך הטרמינציה שבו רנא משתחרר לגמרי מהפטנטים שחוזר למבנה ההליקס המקורי שלו והאנזים עצמו נופל מהפטנטים. מנגנונית יודעים איך הטרמינציה מתרחשת אבל אין רצף שמאפיין את הטרמינציה כך שאפשר יהיה לחזות את זה. ? הבקרה: פרומוטר promoter- לא משועתק אף פעם לרנא. זה הרצף המינימאלי שדרוש לקישור האנזים ולהתחלת השעתוק. טרמינטור terminator- הרצף הדרוש לפירוק הבועית, סילוק האנזים, הפסקת הריאקציה ושחרור הרנא. תכונות הרצף הזה שונות מאוד מה פרומוטר. הרצף שקובע את הטרמינציה כן משועתק. הטרמינציה מתרחשת רק אחרי שהרצף הזה הופך לרנא. ? הפטנט: הפטנט שמוכר הכי טוב זה הפטנט של e.coli. להבדיל מהפטנטים פטנט, דווקא הרנא פטנט למרות כל הפעילויות שהוא עושה מאוד פשוט. הליבה של האנזים מורכבת סהכ מארבע תת יחידות- שתיים זהות של אלפא חשובות לזיהוי והיכירות הפרומוטר. שתי תת היחידות בטא שדומות לאלה בפטנטים פטנט בונות את אותה תעלה של הפטנטים וחשובות לבניית האתר הפעיל. ארבע היחידות האלה הן בעצם בונות את ליבת האנזים שמסוגל לשעתק רנא ולשכפל גדיל אחד. כדי שהאנזים יכיר ויתחיל מהמקום הנכון בפטנטים יש את יחידת סיגמא שחשיבותה היא רק בזיהוי הפרומוטר. אנזים הליבה זה רק ארבע תת היחידות ובצירוף הסיגמא זה מכונה הולו-אנזים. בנוסף יש את תת היחידה אומגה, לא ברור מה תפקידה אבל היא מחוברת גם כן. לתת ל-core enzyme יש יכולת לסנתז את הפטנטים אבל לא להכיר את הפרומוטר. אם נסנתז גדיל פטנטים עם גדיל קומפלמנטרי שבאזור מסוים לא משלים (בועית) יש סיכוי שהליבה של האנזים תסנתז את זה. הליבה תיקשר לפטנטים כי יש לה אפיניות עצומה לפטנטים אבל לא יתרחש שומדבר בלי בועית או זיהוי הפרומוטר. לאנזים השלם עם תת היחידה סיגמא יורדת האפיניות לפטנטים בכל מיקום שהוא אבל עולה האפיניות לפרומוטר בכמה סדרי גודל. ? אנזים הליבה בעל אפיניות עצומה לפטנטים בעיקר דרך קשרי מימן אבל אינו מסוגל להבדיל בשום רצף מסוים בפטנטים. הוא יקשר לכל פטנטים באפיניות גדולה. ברצפים אקראיים הוא יקשר ולא יגרום לשינוי באותם רצפים (לא טופולוגי, לא פתיחה וגם לא ייפול מאותם רצפים). האנזים השלם לעומת זאת, בעל אפיניות נמוכה יותר לאזורים שונים בפטנטים. גם אם הוא נקשר לאזור אקראי הוא מיד ייפול אבל לפרומוטרים באופן ספציפי יש לו מבנה לאזור מסוים והאפיניות מאוד גדולה.

לסיכום

האפיניות של הולו-אנזים שונה לכל פרומוטר. כל פרומוטר הוא מנגנון בפני עצמו. פקטור סיגמא נותן לאנזים את האפשרות להכיר אתר ספציפי בפטנטים ואת האפשרות להתיך אותו. ההתכה נעשית עי תת יחידה אחרת אבל בהיעדר הסיגמא לא תהיה פעילות הליקאז. אם הפטנט מכיר פרומוטר זה טוב כי הוא מזהה את המקום הנכון אבל בגלל האפיניות הגבוהה הזאת אין לאנזים את היכולת לנוע על גבי הפטנטים. מחצית החיים של האנזים והאפיניות לאתרים אחרים בפטנטים, בעקבות קישור הסיגמא, יורדות. ?האפיניות של ההולו-אנזים לפרומוטרים עצומה אבל בתלות בפרומוטר ההבדל בתלות הפרומוטר יכול להיות בין 106 לבין 1012. זה כבר עניין של בקרה כבר ברמת איכות הפרומוטר והאפיניות של הפטנט אליו. כתוצאה מכך גם תדירות ההתחלה מכל פרמוטר שונה. כמעט אין בכלל הולו-אנזים חופשי בתא. כולו נמצא על גבי הפטנטים פשוט בגלל שמספר המולקולות של סיגמא בתא הוא בערך שליש ממספר המולקולות של אנזים הליבה. הולו-אנזים לא יסתובב חופשית בתמיסה או באורגלות, תמיד על גבי פטנטים. כדי שהשעתוק יתחיל מהמקום הנכון בזכות סיגמא ובכל זאת שיתאפשר מעבר אחרי האיניציאציה לאלונגציה, הפתרון הוא מחזור של הסיגמא. הולו-אנזים מזהה את הפרומוטר באפיניות גבוהה, עושה ממנו קומפלקס פתוח ומסנתז 9 בסיסים אבל במעבר לאלונגציה והשתחררות האנזים מה פרומוטר נופלת יחידת הסיגמא. ממצב סטטי למצב תנועה יש דיסוציאציה של הסיגמא ואז האנזים לא ייפול מהפטנטים, יש לו אפיניות גבוהה לכל אזורי הפטנטים וזמן מחצית החיים שלו (בערך שעה) יאפשר סנתוז של הרנא המלא. איך הסיגמא מזהה אזורים מסומים באפיניות כזו גבוהה? - בתא אין מולקולות סיגמא חופשיות אבל במבחנה אפשר לנקות את החלבון של הסיגמא ולערבב עם פטנטים אבל הוא לא ייקשר ללא אנזים הליבה. בחלבון הסיגמא יש סדרה של שיירים (Arg, Thr, Gln, Trp,Tyr) שקשורה ליחידה מסוימת בפרומוטר ויוצרת אפיניות לרצף בסיסים מסוים. כלומר, חומצות אמינו מסוימות יוצרות קשרי מימן עם נוקליאוטידים מסוימים. לבסיסים החנקניים האלה של הנוקליאוטידים יש עוד אלקטרונים שיוצרים עוד קשרי מימן כמו עם פקטור הסיגמא. זאת דוגמא לביצוע האפיניות של הסיגמא לרצף מסוים. בפרוקריוטים יש חשיבות גדולה לרצף הזה אבל גם חשיבות רבה למיקום. האזור הזה שמכיר את הפרומוטר הוא חיפוש פטנטים binding domain, יש לו תכונות מיוחדות לקישור עם הפטנטים (אזור של כ-30-40 קילו-דלטון). רק כאשר פקטור הסיגמא נקשר לאנזים הליבה האזור הזה נחשף ומאפשר קישור לפרומוטר. הסיבה לכך שסיגמא חופשי לא יקשור פטנטים היא שהשייר לא חשוף ואין התחרות על קישור לפטנטים. תת היחידה סיגמא קשורה לפרומוטר ומחזיקה את הפטנטים במיקום לא הכי יציב. כשהיא משתחררת מיקומו משתנה, הפטנטים נכנס לשקע יציב יותר באנזים שם האלונגציה תתרחש. הרנא שנוצר באיניציאציה באמת לא כל כך יציב ונופל הרבה בגלל שהמבנה לא מעניק את היציבות הזו. ההולו-אנזים מזהה את הפרומוטר במהירות עצומה. מהירות הריאקציה לא מובנת. בתוך הקומפלקס הגדול של הגנום, אפילו של ה-e.coli, האזורים של הפרומוטר הם בערך 40-60 בסיסים ובכל זאת עם הוספת ההולו-אנזים תהיה קשירה לפרומוטר. יש לזה לוח זמנים שאפשר למדוד, קצב הקישור של הולו-אנזים לפרומוטר הוא בסדרי גודל של 1014 מולר לשנייה. אי אפשר להסביר את זה בדיפוזיה, הקצב נע סביב 108 מולר לשנייה. אנשים ניסו לתת מודלים שיקטינו את אלמנט הדיפוזיה, כלומר אין דיפוזיה במרחב אלא תנועה על גבי ציר הרישום פטנטים עצמו. העניין הוא שלא מצאו הוכחות לזה. קצב הקישור של הפרומוטר להולו-אנזים הוא אותו קצב של קישור פטנטים כלשהו לאנזים הליבה. הזהות הזאת לא מבדילה בין הזיהוי לקישור פטנטים, זה אותו קצב. הולו-אנזים שמזהה את הפטנטים מזהה כבר את הפרומוטר