שעתוק ועלויות רישום פטנט בישראל ובעולם

בשעתוק יש המון התחלות והמון עצירות, לא כמו ברפליקציה, כל יחידת שעתוק מתחילה רק במקום מסוים ומפסיקה בהתאם. השעתוק מתבצע על גדיל אחד, רפליקציה נעשית בו זמנית על שני הגדילים. כלומר הריאקציה צריכה גם לבחור איזה גדיל היא משעתקת ואיזה לא. הסובסטרטים בשכפול הם דה-אוקסי-נוקלאוטידים ובשעתוק ריבו-נוקלאוטידים. לרוב ה פטנטים פטנט ות יש הגהה אבל אין רנ"א פטנט או ריאקציית שעתוק עם הגהה ותיקון. לגבי רפליקציה יכולה להיות post replication repair, בשעתוק אין תהליך עם יכולת תיקון! התוצר הסופי הוא שבשכפול נוצר גדיל חדש ונשאר קשור אליו (ברוב המקרים), הגדיל החדש נשאר על ה-template. בריאקציות שעתוק מיוצר גדיל שצריך לסלק מה-template, צריך לשחרר אותו כדי שלא יתפוש את מקומו של הגדיל השני. הקישור הוא זמני. אחרי זה יש מערכת שעושה displacement. לגבי פרוססיביות, ל פטנטים פטנטות שונות יש יכולות שונות, בשעתוק בד"כ הפרוס סיביות גבוהה מאוד- מההתחלה ועד הסוף, רנ"א פטנט לא יתחלף באמצע. בנוסף, אין חיבור פרגמנטים וליגציה. הרנ"א שנוצר הוא יחידה עצמאית שלא קשורה ל פטנטים במקום אחר. פטנטים לא ימלא את הפונקציה שלו אם יהיו לו ניקים אבל ברנ"א בכלל אין מצב כזה. חלבוני ליגאז וחלבוני post replication repair לא קיימים במערכת השעתוק. חוסר האנזימטיקה הזה מגבילה את היכולת המניפולטיבית של חוקרים במעבדות, אין אנזימי רסטריקציה או תיקון לרנ"א. תוצר הרצף של השעתוק זהה לרצף של הגדיל שלא עליו נעשתה הפולימריזציה, פרט לכך שבמקום בסיסי T יש U ולכן אפשר לדעת איזה גדיל שימש כתבנית. על סמך השלמת בסיסים עליו נוצרה רישום פטנטים זהה לגדיל שבכלל לא השתתף בריאקציה. זה הגדיל המקודד כי הוא נבחר לסילוק מהריאקציה ורק גדיל התבנית השתתף בה. בניגוד לרפליקציה, כאן יש הבדל בין שני הגדילים. תוצר השעתוק הראשוני נקרא primary transcript משום שבחלק גדול מהמקרים, בעיקר באאוקריוטים, תוצר השעתוק הראשוני לא התוצר שהתא צרים ועליו נעשות הפעולות, הוא בד"כ מאוד לא יציב ומיד כשהוא משתחרר מרנ"א פטנט מתיישבים עליו חלבונים מתאימים. רנ"א עובר דגרדציה מהירה מאוד אלא אם כן הריבוזומים או חלבוני הגנה אחרים מיד מתיישבים עליו. אם הרנ"א לא מקודד לחלבון כמו ה-tRNA, התוצר הוא טרנסקריפט ארוך שיש בו כמה רצפים של רנ"א שבסופו של דבר יש חלבונים שפותחים אותו לכמה רנ"א שונים. באאוקריוטים כמעט כל התוצרים הראשוניים עוברים עיבוד מחדש. מעבר לחיתוכים שכמעט כל רנ"א עובר באאוקריוטים, לרנ"א רבים יש עיבוד של הקצוות. שני הקצוות מקבלים תוספות שמסייעות לתרגום וליציבות, שקשורות למשל גם להובלה של הרישום פטנטים דרך הגרעין לציטופלזמה.

עלויות נוספות

בפרוקריוטים זה לא נחוץ. כל התכונות הבסיסיות- מנגנון הפעולה מבחינה ביוכימית, התקדמות הריאקציה על סמך זיווג בסיסים וכד קיימות ברנ"א פטנט. תכונות ייחודיות לרנ"א פטנט: להבדיל מהד"נא פטנט הרנ"א פטנט צריך להיות אנזים שיבחר את הגדיל לתבנית. הוא לא זקוק לפריימר, הוא יכול לעשות את הקשר הראשון בין שני נוקליאוטידים. לכן גם התוצר, אם לא יהיה עיבוד של קצה 5 דומה לתוצר של פטנטים אבל יהיה שונה בקצה כי יהיו עליו שלושה פוספאטים על הנוקליאוטיד הראשון בתהליך השעתוק. לא על כולם יהיה אבל עם לא יהיה עיבוד זה מה שיהיה בקצה 5. האנזים הזה בוחר לעצמו את נקודת ההתחלה בפרוקריוטים. באאוקריוטים לעומת זאת יש מערכת שלמה שמביאה את הרנ"א פטנט למקום הנכון, אין לו פעילות של 3 ל-5 ולכן שיעור השגיאה הוא בכמה סדרי גודל גדול יותר מהשכפול. למשל ב-e.coli כתוצאה מהגהה, תיקון ו- post replication repair שיעור השגיאה הוא בערך כל 1010 ובשעתוק יש שגיאה כל 104 בסיסים. תהליך ריאקציה של שעתוק- מחזור מוצלח של הריאקציה אומר שהפטנט נקשר במקום מוצלח באזור ההתחלה של השעתוק- קרוב לאזור הפרומוטר, הוא משכפל גדיל אחד לאורך אזור ה-transcription unit ובהמשך הפטנט נופל בנקודת הטרמינציה. יחידת השעתוק יכולה להכיל מספר גנים, מספר תוצרים. כלומר, המחזור הזה מתחיל בנקודת התחלה ומסתיים בנקודה אחרת. לכל יחידת שעתוק כזו נקודות ההתחלה והסיום מדויקות מאוד. ישנם מקרים בהם יש כמה נקודות התחלה- לפעמים נוקליאוטידים בודדים או עשרות נוקליאוטידים אחרי. למרות שאי אפשר לזהות איפה בדיוק יתחיל השעתוק אפשר להעריך איפה יקשר הפטנט ובכל פעם שם תהיה ההתחלה. יחידת השעתוק מוגדרת מאוד. בגלל שיש אלמנטים רגולטורים, לא משתתפים בריאקציה עצמה לא כתבנית ולא מקודדים, מגדירים אותם באזור שהוא upstream מהמערכת, מיחידת השעתוק. Upstream מתייחס לנוקליאוטיד הראשון על גבי התבנית שיופיע ברנ"א, אותו מכנים 1+. כל מה שנמצא upstream מקבל מספרים שליליים. הרנ"א פטנט מחובר לרצפים השליליים. הטרמינטור נמא בהמשך הרצפים החיוביים- בתוך יחידת השעתוק- downstream. שעתוק ב-e.coli מתקדם בקצב של בערך 40 נוקליאוטידים בשנייה, פטנטים פטנט 3 עושה בערך 2000 נוקליאוטידים בשנייה בתהליכי הרפליקציה אבל תהליכי השעתוק איטיים בהרבה. הדרישה מאנזים השעתוק היא שיקשר לפטנטים במקום הנכון, יבחר את הגדיל הנכון בלי פריימר בכלל, יעשה התכה של הפטנטים (הליקאז) ששני הגדילים ייפרדו ואז יתחיל לשעתק. ברפליקציה יש קומפלקס מאוד גדול שמכין את השטח לפטנטים פטנט 3, בשעתוק ב-e.coli אין את כל המערך הזה לפני השעתוק. חלק גדול מהריאקציות האנזימטיות הדרושות מתבצע ע"י רנ"א פטנט עצמו. אין לו חלבונים מייצבים או מזהים לפני כן, אין חלבון שעושהunwinding או displacement. הכל עושה רנ"א פטנט פרט לכך שכתוצאה מפתיחת הגדילים צריך פעילות של טופואיזומראזות כתוצאה ממתח שנכנס לרישום פטנטים. בד"כ נוצר מתח חיובי downstream והפטנטים שלפניו צריך להיות הרבה יותר קומפקטי. מאחוריו יש אלמנטים של מתח שלילי. הטופואיזומראזות ב-e.coli לא הולכים עם הרנ"א פטנט. כשרנ"א פטנט נקשר למקום, אפשר לראות גם במיקרוסקופ אלקטרוני הוא יוצר בלון רפליקציה- קומפלקס די גדול של 5 חלבונים שהוא עצמו מבצע גם את ה-unwinding במקום הנכון, גם את התחלת הסינתזה, וכל הבלון הזה נע תוך סילוק גדיל אחד החוצה וסינתזה של תחילת הגדיל על גבי גדיל תבנית. חייב להיות חלבון אחר שיסלק את הרנ"א שנוצר החוצה. כל זה נדרש מרנ"א פטנט ב-e.coli. ככל שהאנזים מתקדם יש לו פעילות של הליקאז ופתיחת ההליקס, קישור של הגדיל המקודד שלא יפריע לריאקציה (מבחינה מבנית הוא ממש נכנס לתעלה שעוטפים אותו חלבונים), בניית אתר פעיל לתוכו נכנסים נוקליאוטידים שמאריכים את הרנ"א המסונתז, ואחרי כל תנועת הבלון ימינה יש יחידה אחרת בפטנט שגורמת ל-displacement הזה. בכל נקודת זמן ההיבריד רנ"א-פטנטים מאוד קטן. איך שהריאקציה זזה כל הזמן נפתחים הקשרים בין הרנ"א לפטנטים ומתחדש הקשר בין הגדיל המקודד לגדיל התבנית באתר ה- rewinding point של הפטנט. באופן כללי בזמן תהליך השעתוק כשהבלון רץ על הפטנטים הוא תופש כ-25 עד 30 בסיסים. בגלל כל החלבונים שהוא נושא זה תופש יותר. באופן מאוד סכמטי אפשר לראות שיש תת יחידות עם תפקידים מאוד מוגדרים בפטנט- שתי תת יחידות שתופשות את הפטנטים, תת יחידה שבונה את התעלה ונקשרת לגדיל המקודד שלא יפריע לריאקציה, תת יחידות- דומיינים של האתר הפעיל ותת יחידה ספציפית שבה ההיבריד של רנ"א פטנטים נפרד. יש גם אתר ספציפי לכניסה של ריבו-נוקליאוטידים. כל התהליך גורם למתח מבני עצום ברישום פטנטים, יש supercoiling חיובי לפנים ושלילי מאחור. יום שישי 29 פברואר 2008 שעתוק- המשך... בתוך אותו קומפלקס שרץ על גבי הפטנטים מתרחשות כמה ריאקציות שבונות את תהליך השעתוק. יש unwinding של הליקאז, משתחרר פטנטים דו גדילי מאחורה שעובר re-winding. האנזים מפריד מהריאקציה גדיל אחד של פטנטים, הגדיל המקודד שלא משתתף בריאקציה. רק את גדיל התבנית משעתקים ועל גביו מסונתז הרנ"א. לאחר מכן יש הפרדה של ההיבריד. הרנ"א החדש משתחרר כדי לאפשר לאזור התבנית ששועתק לפגוש מחדש את הגדיל המקודד ב-re-winding. לא ברור איך מתבצעת התנועה מבחינה מנגנונית אבל מבחינה סכמטית מוכרות כל היחידות שעושות את הריאקציות האלה. פתיחת גדיל אפילו של כמה בסיסים מכניסה מתח מאוד גדול לסביבה ולכן טופואיזומראזות עובדות upstream ו-downstream. מקדימה נוצר supercoiling חיובי ומאחורה שלילי. חשוב מאוד לשמור על המבנה הטופולוגי בפעילות. לא תמיד חייבים לראות in vivo באמת supercoiling חיובי כי יכול להיות שכבר הייתה רלקסציה או שיהיה דווקא supercoiling שלילי. במבחנה בלי הפרעות זה פשוט מה שרואים. המבנה הסכמטי והציורים מבוססים על מבני גבישים אמיתיים של הרישום פטנטים שאנשים הצליחו לפתור, בזמן נתון. המבנה הזה של רנ"א פטנט עם תת היחידות שלו ופטנטים הוא עם קשרים מאוד אדוקים, קיים מגע לאורך כל החלבון עם הפטנטים. בנקודה שמתבצע unwinding נוצרת תעלה קצרה שאוחזת את הגדיל המקודד, תת היחידות בטא של האנזים בחלק הזה סוגרות על הגדיל ומונעות ממנו להשתתף בריאקציה. בנקודה שהגדיל יוצא חזרה יש חלבון בין הרנ"א לגדיל המקודד שבא כהפרדה כדי לאפשר לפטנטים להתחבר חזרה ולא להתחבר לרנ"א, למרות שגם ככה האפיניות של הפטנטים לפטנטים הרבה יותר גדולה. בעצם הריאקציה מכילה רצף מאוד קטן של רנ"א כנגד template. אפשר למדוד בזמן נתון את כל נקודות המגע בין חלבון לפטנטים. בד"כ חלבונים על פטנטים מגנים על הפטנטים מפני נוקלאזות. אפשר לראות בשיטות שונות עם נוקלאזות מה "נאכל" ומה לא. באזור upstream לריאקציה, הרבה יותר קל לתפוש את האנזים על הפטנטים, בפרומוטר. על גבי האזור הזה הצליחו לראות את חומצות האמינו שיצרו קשרים (בד"כ קשרי מימן) עם הפטנטים. רוב נקודות המגע של האנזים והפטנטים הן דווקא על הגדיל המקודד. זאת אומרת שנקודות המגע מרוכזות באזורים מסוימים. נקודת ההתחלה זה הנוקליאוטיד על גבי הפטנטים שיהיה גם הנוקליאוטיד הראשון של הרנ"א, ממנו ייווצר הקשר הראשון. האזורים בפטנטים שיש להם אפיניות גדולה לאנזים מלמדים כמה דברים- רוב הנקודות הן בגדיל המקודד ויש כמה אזורים שקושרים טוב יותר את החלבון. הפוזיציה של הנוקליאוטיד קובעת במידה רבה את היכולת להיקשר לחלבון, יותר מהנוקליאוטיד עצמו. המבנה התלת ממדי של הפטנטים באותו אזור, קשרי המימן שפתוחים באותו אזור, יכולים להיות איזו-פורמים של פטנטים שיוצרים מבנה תלת ממדי אליו החלבון יכול להיקשר. לאנזימים יש יכולת להכיר את המבנה התלת ממדי ואת היכולת ליצור אינטראקציות. שתי תת היחידות בטא של הפטנטים פטנט עוטפות בצורה דומה מבחינת המבנה את גדילי הפטנטים שמופרדים, אך יש שוני- האנזים רנ"א פטנט לא מקיף לגמרי את הפטנטים. בפטנטים פטנט נוצר חור שעוטף °360 מעלות את הגדיל, לעומת זאת ברנ"א פטנט יש חור של כ-°70 עד °80 מעלות. המערכת האאוקריוטית הרבה יותר מורכבת. יש לה 12 תת יחידות, יש שתי תת יחידות שמתחברות רק בשלב מסוים למבנה אבל הן חשובות לריאקציה. במבחנה צריך לספק את כל ה-12 ולא רק 10. יחד עם זאת אפשר לעשות knockout לגן הרנ"א פטנט ועדיין ייווצר רנ"א. התארגנות תת היחידות של רנ"א פטנט של אאוקריוטים- דרך הגביש ניסו להבין איך הרנ"א פטנט בכלל יכול לרוץ על הפטנטים ולתפוש אותו. ההשערה היא שכאשר הרנ"א פטנט מזהה את הפטנטים באזור הפרומוטר, אין סגירה מלאה של האנזים, הפטנטים כן יכול להיכנס ורק אח"כ יש את תת היחידה clamp שסוגרת את החלבון ונוצר אתר פעיל תקין. הקיר הזה שמתחבר לאנזים גורמת לפטנטים להמשיך לצאת השני של האנזים בזווית מסוימת ולא ב-°180 מעלות כפי שנכנס. כל הריאקציה הזאת מתרחשת באמצעות שני יוני מגנזיום ולכן יכלו לאתר את האתר הפעיל בדיוק בגביש. בפרוקריוטים בניית הזווית הזאת של היציאה והאתר הפעיל מאוד דומה