חיפוש פטנטים

קיים הבדל עקרוני בין היצירה והשמירה של מצב זה בתאים פרוקריוטים ואאוקריוטים. בתא הפרוקריוטי מצב ה-supercoiling נקבע ושמר עי פטנטים גיראז. לעומת זאת, בתאים אאוקריוטים עד היום לא נתגלה פטנטים גיראז, אין אנזים שמבצע supercoiling ובכל זאת גם פלסמידים, נגיפים והגנום שלנו נמצא במצב כזה. ההיפותזה היום שהמצב בתאים אאוקריוטים נקבע כולו מהכריכה סביב המבנה של הנוקלאוזום. כלומר הנוקלאוזום קובע מצב של supercoiling בתא. הציבוב על הציר של החלבון משנה את Wr אבל בהמשך נוצר פיתול, אם במערכת טופולוגית סגורה והשתנה Wr במקום אחד אז זה ישנה גם את ה-Tw כי ה-Lk לא משתנה. אם אחרי השינוי הזה תתרחק רלקסציה לאזור שלא כרוך סביב החלבון (תיפתח המערכת לשחרור הפיתולים בחלק החופשי) אז יתקבל supercoiling כשישתחרר הפטנטים מהנוקלאוזום. כיום יודעים שזה מה שקורה, כשמבודדים את הפטנטים ושולפים את האוקטומר ההיסטוני הפטנטים הוא supercoiling. יש נגיפים שמדביקים תאים ביונקים, SV40 עם פטנטים דו חוטי מעגלי, וכשהם נכנסים לתא הם נקראים כנוקלאוזומים. יש הרבה אינפורמציה על כריכות של הפטנטים ועל העובדה שעל גבי הנוקלאוזום יש רלקסציה ודווקא היא בסופו של דבר מביאה ל- supercoiling. כשסופרים את ה- supercoiling אפשר לדעת כמה סיבובים היו בכריכה. בקרה על המצב הטופולוגי בחיידקים: המצב הטופולוגי מוכתב עי טופואיזומראז. יש שני אופני בקרה: (1) מתבסס על הפעולה אנטוגניסטית של גיראז שמסוגל לבצע supercoiling וטופואיזומראז 1 שעושה רלקסציה. (2) בקרה הומיאוסטטית של הגנים לגיראז וצורת ההתבטאות שלהם. הגורמים המשפיעים על מצב הטופולוגיה בתא זה יחס ATP/ADP היות ו-ATP לא דרוש לטופואיזומראז 1 אבל כן לגיראז אז היחס קובע את יחס הפעולה שלהם. פעולה של גיראז בתא חיידק- כאשר מבודדים מתוך תרבית פלסמידים, ה- super helical density כמעט זהה, יש שינוי של 10% בין רמת ה- supercoiling של האוכלוסייה. כלומר יש משהו שמבקר ברמה די הדוקה את המצב הטופולוגי של החיפוש פטנט. אם לוקחים את אותם פלסמידים ונותנים את כל התנאים לריאקציה, גיראז יגיע לפעילות הרבה יותר גבוהה כלומר ל-Lk הרבה יותר נמוך. הפעילות גבוהה מהפעילות בתא. כלומר בתא יש משהו שמגביל את הפעולה של האנזים, הוא לא מגיע לגבול היכולת שלו. אחד הגורמים העיקריים המבקר את פעולתו זה טופואיזומראז 1 שעושה רלקסציה. אם אנחנו משתיקים את הפעולה של טופואיזומראז 1 ומשאירים את גיראז לעבוד בעצמו התאים מתים. החסרה של הגן או השתקה שלו היא לטאלית, הפטנטים מגיע למצבים בהם הוא לא מתפקד. אם מסתכלים על זה בעיון מוצאים שחלק קטן מהתאים שורדים את התהליך. מסתבר שהפטנטים שלהם הוא במצב של super coiling הנסבל מבחינת התא. מסתבר שיש לתאים אלה מוטציות מפצות. המוטציה היא בגן לפטנטים גיראז. זאת אומרת שחלה מוטציה בגנים לפטנטים גיראז ולכן הפעילות שלו נמוכה. התוצאה הנוספת היא שאפשר היה לשבט את הגנים המקודדים לגיראז בפלסמידים ולבדוק את הפעולה שלו in vitro בטופואיזומרים שונים של אותו פלסמיד שמכיל את הגנים האלה ולבדוק את פעילות האנזים. התברר שככל שהפטנטים שבו הוא נמצא עם הגנים נמצא ב- super coiling הגיראז מתבטא פחות. יכול להיות שגם בתא, ככל שרמת ה-super coiling עולה מתבטא פחות גיראז. יש יותר מבקרה אחת על עוצמת הביטוי של הגיראז. מסתבר שיש סדרות מאוד ספציפיות של גנים שמאוד רגישות לדרגת ה-super coiling. נגדיר שתי דרכים להשפעת הטופואיזומראזות בתא: (1) דרך עקיפה, עי שינוי מצב טופולוגי של פטנטים בתא. אם טופואיזומראז גורם ל-supercoiling שלילי הוא מונע ביטוי של גנים. האנזים עצמו לא מעורב בתהליך הוא רק יוצר את התנאים. (2) דרך ישירה, טופואיזומראזות יכולים לשבור ולחבר קשרים בפטנטים. תהליכים כאלה בשלד הרישום פטנטים ובריאקציות כאלה, טופואיזומראז יכול להיות שותף ישירות. טופואיזומראזות מעורבות בכמה פעולות בתא. תהליך הרפליקציה (בשני האופנים- עקיפה או ישירה), בשעתוק, רקומבינציה גנטית ובמבנה ודחיסה של הפטנטים במבנה הכרומטין. ברפליקציה טופואיזומראזות מעורבות גם בתחילת תהליך ההכפלה ישירות ועקיפין, בתהליך הארכת השרשרת ובתהליך הסיום. באיניציאציה (תחילת ההכפלה) בדרך עקיפה הן מעורבות ביצירת supercoiling. קיימות מערכות בהן טופואיזומראז משמש בעצם יצירת הפריימר לריאקציה. החלבון שמכיר את אתר ההתחלה ומבקע בו קשר פוספו-די-אסטרי שהקצה שלו משמש כפריימר זה טופואיזומראז 1. זו מעורבות ישירה לחלוטין באיניציאציה. בדרך השנייה שבה יש מעורבות בהכפלה זה באלונגציה (הארכת השרשרת). הליקאז מפריד את חוטי הפטנטים נוצר מזלג הכפלה וההכפלה מתקדמת. בקדמת מזלג ההכפלה נוצר מתח נגדי למתח המזלג. מי שמשחרר את המתח הזה הוא טופואיזומראז 2. אם לא תהיה רלקסציה המזלג ייעצר. המעורבות הבאה היא בסגרגציה- הפרדת המולקולות שנוצרו. זה נכון לא רק לגבי מולקולות מעגליות אלא גם בשלנו, ברגע שמערכת של פטנטים מעגלי מוכפלת שני המעגלים משולבים זה בזה (הבת והאם). מי שמפריד אותם לסגרגציה זה טופואיזומראז 2 גם כן. ידועים מוטנטים בשמרים בהם אנחנו פוגעים בגן המקודד לטופואיזומראז 2 ואחד התהליכים בו אנחנו פוגעים זה הסגרגציה של המולקולות. רקומבינציה גנטית זה גם תהליך שמערב את הטופואיזומראזות- מבחינה עקיפה זה מקושר לרקומבינציה הומולוגית, שם יש חדירה של סרט אחד לפטנטים דו חוטי. לצורך זה צריך לבצע unwinding. זאת התרומה של טופואיזומראזות. מבחינה ישירה, ברקומבינציה לא הומולגית (או בלתי חוקית) מתבצע חיתוך וחיבור של שני קטעי פטנטים. זו פעולה אידיאלית לטופואיזומראז.